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Tag雜不出來?是否蛋白標簽抗體選錯了?
文章來源:上?婆d商貿有限公司   添加時間:2020/10/22 11:51:48 點擊率:797

做重組蛋白表達實驗時,Tag雜不出來的情況很常見,這時,辛辛苦苦做的實驗又得重新來過,著實懊惱!然而懊惱并沒什么用,解決問題才是王道,你可以從蛋白標簽抗體方面來尋找解決的辦法。

什么是蛋白標簽?

重組蛋白表達技術現已經廣泛應用于生物學各個具體領域,特別是體內功能研究和蛋白質的大規模生產都需要應用重組蛋白表達載體。

蛋白表達載體按照表達宿主的不同可分為3類,分別為:表達宿主為大腸桿菌、哺乳動物細胞,以及慢病毒載體,宿主可以為哺乳動物細胞和原代細胞?蒲腥藛T將一些肽類和蛋白質與目的蛋白融合表達,以便于目的蛋白表達、檢測、示蹤和純化。這類多肽或蛋白,被稱為蛋白標簽(Protein Tag)。

蛋白標簽表達過程一般實驗包括載體構建——表達鑒定——蛋白純化3大步驟。在構建載體階段,還需要考慮密碼子的優化以及標簽的選擇。選擇合適的標簽,不僅要有利于蛋白的純化,促進蛋白的可溶性,同時也不能影響蛋白的結構功能及下游應用。

各類蛋白標簽的優缺點

除了必要的復制和篩選的元件,協助表達和翻譯的元件外,各類載體分別按照功能標簽的不同分為以下種類,每類蛋白標簽的功能均有差異,各有優缺點,適用實驗范圍也各有差異。

His6 /His-Tag

His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽,可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用,一是能構成表位利于純化和檢測;二是構成獨特的結構特征(結合配體)利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力,可用于固定化金屬螯合層析(IMAC),對重組蛋白進行分離純化。使用His-tag有下面優點:

標簽的分子量小,只有~0.84KD, 而GST和蛋白A分別為~26KD和~30KD,一般不影響目標蛋白的功能;

1.His標簽融合蛋白可以在非離子型表面活性劑存在的條件下或變性條件下純化,前者在純化疏水性強的蛋白得到應用,后者在純化包涵體蛋白時特別有用,用高濃度的變性劑溶解后通過金屬螯和親和層析去除雜蛋白,使復性不受其它蛋白的干擾,或進行金屬螯和親和層析復性;

2.His標簽融合蛋白也被用于蛋白質-蛋白質、蛋白質-DNA相互作用研究;

3.His標簽免疫原性相對較低,可將純化的蛋白直接注射動物進行免疫制備抗體;

4.可應用于多種表達系統,純化的條件溫和;

5.可以和其它的親和標簽一起構建雙親和標簽。

Flag

Flag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽(DYKDDDDK),同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。FLAG作為標簽蛋白,其融合表達目的蛋白后具有以下優點:

1.Flag作為融合表達標簽,其通常不會與目的蛋白相互作用并且通常不會影響目的蛋白的功能、性質,這樣就有利用研究人員對融合蛋白進行下游研究;

2.融合Flag的目的蛋白,可以直接通過FLAG進行親和層析,此層析為非變性純化,可以純化有活性的融合蛋白,并且純化效率高;

3.Flag作為標簽蛋白,其可以被抗FLAG的抗體識別,這樣就方便通過Western Blot、ELISA等方法對含有FLAG的融合蛋白進行檢測、鑒定;

4.融合在N端的Flag,其可以被腸激酶切除(DDDK),從而得到特異的目的蛋白。因此現FLAG標簽已廣泛的應用于蛋白表達、純化、鑒定、功能研究及其蛋白相互作用等相關領域。

GST

GST(谷胱甘肽巰基轉移酶) 標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶,它的天然大小為26KD。將它應用在原核表達的原因大致有兩個,一個是因為它是一個高度可溶的蛋白,希望可以利用它增加外源蛋白的可溶性;另一個是它可以在大腸桿菌中大量表達,起到提高表達量的作用。

GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達,可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM 還原型谷胱甘肽洗脫。在大多數情況下,融合蛋白在水溶液中是可溶的,并形成二體。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。在大多數情況下GST融合蛋白是完全或部分可溶的。其具有以下優點:

1.GST標簽蛋白是一個高度可溶的蛋白,增加外源蛋白的可溶性;

2.GST標簽蛋白可在大腸桿菌中大量表達,起到提高表達量的作用;

3.GST標簽蛋白很好地保留了蛋白的抗原性和生物活性,提高外源蛋白的穩定性;

4.GST標簽蛋白高特異性,純化方便且溫和。

但GST標簽蛋白較大,對目的蛋白有一定影響,可能會干擾蛋白質的功能及下游實驗。

HA

HA標簽蛋白,標簽序列YPYDVPDYA,源于流感病毒的紅細胞凝集素表面抗原決定簇,9個氨基酸,對外源靶蛋白的空間結構影響小, 容易構建成標簽蛋白融合到N端或者C端。其具有以下優點:

1.HA標簽具很強的免疫反應性,被廣泛用于HA融合目的蛋白的分離、純化、檢測和示蹤;

2.重組的HA標簽蛋白可以使用偶聯有HA高特異性單克隆抗體的樹脂來完成高效純化;

3.HA標簽系統HA標簽可位于蛋白質的C端或N端,該系統已廣泛應用于多種細胞類型,相應的HA標簽抗體也被廣泛應用,HA標簽抗體能特異識別C末端或N末端帶有HA標簽(HA-tagged)的融合蛋白。

c-Myc

C-Myc標簽蛋白,是一個含11個氨基酸的小標簽,標簽序列Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu,這11個氨基酸作為抗原表位表達在不同的蛋白質框架中仍可識別其相應抗體。C-Myc tag已成功應用在Western-blot雜交技術、免疫沉淀和流式細胞計量術中, 可用于檢測重組蛋白質在靶細胞中的表達。其特點如下:

1.C-Myc可用于檢測重組蛋白在細菌、酵母、昆蟲細胞和哺乳細胞中的表達情況。

2.C-Myc重組蛋白質可通過偶聯Myc標簽抗體到二乙烯砜活化的瓊脂糖上而進行親和純化。

3.C-Myc標簽可放在C端或N端,但C-Myc重組蛋白的低pH洗脫條件往往會降低蛋白質的活力,因此C-Myc標簽系統廣泛應用于檢測但很少用于純化。

GFP

GFP(綠色螢光蛋白)是由下村修等人在水母中發現的。它在藍色波長范圍的光線激發下,會發出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質的C端或N端,該系統已廣泛應用于各種細胞類型,包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等,相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質之間相互作用和構象變化中,起到了重要的作用。其優點如下:

1.不用破碎組織細胞和不加任何底物,直接通過熒光顯微鏡就能在活細胞中發出綠色熒光,實時顯示目的基因的表達情況,而且熒光性質穩定,被譽為活細胞探針;

2.其自發熒光,不需用目的基因的抗體或原位雜交技術就可推知目的基因在細胞中的定位等情況;

3.同時細胞內的其它產物不會干擾標簽蛋白檢測,從而使其檢測更顯得快速、簡便、靈敏度高而且重現性。

MBP

MBP(麥芽糖結合蛋白)標簽蛋白大小為40kDa,由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性,尤其是真核蛋白。MBP標簽可通過免疫分析很方便地檢測。有必要用位點專一的蛋白酶切割標簽。如果蛋白在細菌中表達,MBP可以融合在蛋白的N端或C端。其特點如下:

1.簡單親和純化;

2.增加蛋白表達量和蛋白穩定性;

3.促進蛋白的可溶性和正確折疊;

4.標簽較大,對目的蛋白可能會有一定影響;

如果要去除MBP融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。

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